Validation d’essais cliniques pour le séquençage du SRAS-CoV-2 à l’aide du panel d’amplicons Swift Biosciences

La propagation du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) dans le monde entier, provoquant des vagues successives de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19), a conduit à des recherches intensives sur le SRAS-CoV-2, ainsi que sur sa détection et son traitement. L’un des fils conducteurs les plus importants a été la nécessité de détecter les variantes nouvelles et émergentes du SRAS-CoV-2, car elles sont souvent associées à une transmission et à une gravité de la maladie plus importantes.

Les méthodes de séquençage basées sur l’amplicon ont été largement utilisées à cet égard. Pourtant, les preuves de leur utilité manquent encore d’exhaustivité et de force. Étude : Caractéristiques de performance clinique du panel d’amplicons Swift Normalase pour la récupération sensible des génomes du SRAS-Cov-2. Crédit d’image : Zita/Shutterstock.com

Fond

Des millions de génomes du SRAS-CoV-2 sont accessibles au public pour analyse, à l’aide de plates-formes de séquençage de nouvelle génération qui permettent une surveillance génomique dans des conditions quasi réelles. Cela comprend le séquençage du génome entier (WGS) d’isolats viraux de patients positifs au COVID-19, qui jouent un rôle majeur dans l’enquête sur les épidémies locales, la planification des interventions, le développement d’agents pharmaceutiques préventifs et thérapeutiques, ainsi que l’évaluation de l’efficacité de ces médicaments.

Les variantes préoccupantes du SRAS-CoV-2 (COV) sont de nouvelles variantes liées à une transmissibilité plus élevée, à une efficacité réduite du vaccin et à des résultats indésirables, généralement en raison d’ensembles spécifiques de mutations qui entraînent une évasion immunitaire et une réplication virale améliorée. Encore une fois, le séquençage est essentiel pour identifier de telles mutations et développer des anticorps monoclonaux. Enfin, l’émergence de nouvelles souches chez les patients immunodéprimés atteints de COVID-19 chronique peut être surveillée par de telles technologies.

Le séquençage d’amplicons multiplexés est préférable au séquençage au fusil de chasse ou aux méthodes de séquençage basées sur la capture pour sa sensibilité, sa rapidité et son faible coût accrus. Auparavant, les auteurs de la présente étude publiée sur le medRxiv * serveur de préimpression a démontré qu’un tel panel pouvait récupérer des génomes jusqu’à un seuil de cycle (Ct) sur de nombreux isolats.

L’amorce Swift SNAP, qui fait l’objet de la présente étude, est conçue de manière complémentaire au génome ancestral Wuhan-Hu-1 et amplifie 345 amplicons sur l’ensemble du brin d’acide ribonucléique (ARN). Cette amorce nécessite trois heures ou moins pour concevoir des bibliothèques d’amplicons, de seulement 10 à 100+ copies du virus. Un traitement ultérieur peut être effectué manuellement ou par voie enzymatique en utilisant des formulations exclusives.

Étant donné l’absence de directives pour l’évaluation des tests WGS pour le SRAS-CoV-2, la présente étude a utilisé les directives de la Food and Drugs Administration (FDA) des États-Unis pour valider le SRAS-CoV-2 Swift Normalase Amplicon Panel (SNAP) à un tube. Version 2.0 de Swift Biosciences.

C’est la première fois qu’une telle validation est effectuée sur ce test disponible dans le commerce qui a été utilisé dans un certain nombre d’essais de vaccins et d’études de recherche.

Résultats de l’étude

Les chercheurs ont découvert qu’ils étaient capables de récupérer des génomes de haute qualité à partir d’échantillons positifs au COVID-19 avec une limite de détection de 95 % de 40 copies du SARS-CoV-2 par amplification en chaîne par polymérase (PCR), à des concentrations de 82 copies/réaction ou Suite. Les génomes ont été récupérés sur une plage de valeurs Ct d’environ 11 à 37, avec une valeur médiane de 22.

Les chercheurs n’ont pas récupéré de génomes à partir d’échantillons négatifs par PCR ou positifs pour d’autres virus. Ils ont obtenu une identité par paire pour les séquences consensus à 100 % dans tous les cas.

Les génomes répliqués récupérés sur le même cycle ou sur des cycles différents étaient de bonne qualité, dans la mesure où les fréquences alléliques étaient hautement concordantes entre les bibliothèques de séquençage Swift et shotgun. L’utilisation de différents instruments a également permis d’obtenir un degré élevé de reproductibilité. Les chercheurs ont en outre découvert que les souches de COV et non COV étaient correctement identifiées, à l’aide d’ensembles de données de référence des Centers for Disease Control and Prevention (CDC) des États-Unis.

Des mélanges de différents clades de SARS-CoV-2 sur une gamme de ratios ont conduit à la détection des souches attendues même à un ratio de 1:99. Une fois publié pour une utilisation clinique, le test a été utilisé près de 270 fois au cours des 23 premières semaines. Le délai d’exécution médian était de 11 jours et son utilisation était principalement destinée à enquêter sur les épidémies et à contrôler les infections.

Fréquence allélique mesurée (axe des y) pour toutes les mutations attendues (n = 20) dans les mélanges d’échantillons décrits dans Tableau 2. Panneaux bleus = mutations communes aux échantillons 20A et 20B, panneaux oranges = mutations attendues dans l’échantillon 20B, panneau violet = mutations attendues dans l’échantillon 20A.

Implications

Les résultats de la présente étude confirment que les panneaux d’amplicons PCR multiplex peuvent être utilisés pour réaliser le séquençage à haut débit du SARS-CoV-2. Non seulement ils peuvent être utilisés pour récupérer des génomes sur un large spectre de charges virales, mais ils réduisent également la durée du flux de travail.

La validation de cette plate-forme à l’aide des directives de la FDA applicables aux autres tests NGS de la présente étude montre qu’elle peut être utilisée lors de travaux cliniques de routine dans tout laboratoire approuvé par les Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA) et le College of American Pathologies (CAP). L’approche discutée ici était à la fois très sensible, avec une limite de détection de génomes entiers à 40 copies par réaction, et s’est avérée récupérer avec précision les fréquences alléliques parmi les échantillons mixtes.

Ceci est essentiel pour évaluer la variation de la lignée SARS-CoV-2 au sein d’un même hôte, comme cela peut se produire après la vaccination ou le traitement. En fait, le séquençage d’amplicons peut être plus pertinent pour capturer des allèles avec des fréquences mineures par rapport aux technologies de séquençage basées sur la capture.

Le panneau Swift SNAP peut être directement utilisé avec les technologies de lecture courte car il produit des amplicons de moins de 255 paires de bases (pb) par rapport à d’autres comme ARTIC, qui, bien que peu coûteux, produisent des amplicons de plus de 400 pb. Cela signifie qu’une fragmentation supplémentaire est nécessaire avant l’utilisation du séquençage basé sur Illumina ou du séquençage direct basé sur Oxford Nanopore Technologies (ONT).

Étant donné que plus d’amorces sont utilisées dans ce panel, ainsi que des amplicons qui se chevauchent, les abandons d’amplicons sont relativement faibles. La capacité de ce panel dans des paramètres optimisés recommandés par le fabricant à récupérer des génomes sur une plage de valeurs de Ct, comme dans des spécimens réels, est un autre avantage.

La disponibilité d’une étape de normalisation enzymatique propriétaire en option (Normalase) peut produire des pools équimolaires couvrant également une gamme d’échantillons et d’amplicons, facilitant ainsi la gestion des échantillons en lots importants plutôt que d’ajouter plus de cycles d’amplification. Ce dernier peut conduire à des analyses de faible qualité en raison d’une dimérisation excessive des amorces, ainsi que de l’amplification de traces de contaminants.

“Nos résultats démontrent la sensibilité, la spécificité et la reproductibilité élevées du panneau d’amplicons Swift SNAP pour le SRAS-CoV-2, ce qui le rend idéal pour les applications cliniques.”

Les chercheurs fournissent un lien vers le protocole à l’adresse https://www.protocols.io/view/uw-virology-swift-snapv2-protocol-byw4pxgw. Cela peut être utilisé avec des systèmes robotiques et est applicable pour la validation d’autres méthodes de séquençage d’amplicons.

*Avis important

medRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique/le comportement lié à la santé, ou traités comme des informations établies.

 
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